Белок 50К клетки-хозяина считается наиболее вероятным «кандидатом» в клеточные опухолевые антигены. В последние годы получила признание гипотеза, объясняющая механизм трансформации под действием онкогенных ретровирусов. Согласно этой гипотезе, вирусные киназы участвуют в реакциях фосфорилирования, при этом взаимодействуя и активируя целый каскад клеточных киназ, что может явиться ключевым моментом в нарушении регуляции клеточного роста [Spector М. et al, 1981].Как оказалось, у ретровирусных онкогенов и кодируемых ими продуктов имеются аналоги в нормальных клетках.В ДНК неинфицированных клеток позвоночных животных были найдены нуклеотидиые последовательности (с-onc), гомологичные всем известным вирусным трансформирующим генам (v-onc) и существующие в клетке наряду с другими нормальными клеточными генами. Н. Varmus и соавт. (1977, 1978) выявили в неинфицированных клетках цыплят последовательности, комплементарные последовательностям гена src RSV. Эти гены могут рассматриваться как потенциальные онкогены человека (протоонкогены). Эндогенные клеточные аналоги вирусных онкогенов структурно очень близки с вирусными онкогенами, например (c-src и v-src), но, как правило, гены с-onc более сложно организованы и содержат несколько некодирующих районов— нитронов [Parker R, Varmus Н, Bishop J. М, 1981; Franchini G. et al, 1981]. На основании подобных фактов было высказано предположение, что вирусный геном включает в свой состав клеточные последовательности с-onc, т. е. иначе говоря, вирусные онкогены произошли из нормальных последовательностей клетки-хозяина — потенциальных клеточных онкогенов (протоонкогенов). Впоследствии эта гипотеза была подтверждена экспериментально.

Идентифицированы также вирусиндуцированные специфичные для трансформации белки — продукты соответствующих трансформирующих генов.Если раньше считали, что ретровирусы не индуцируют образования ядерных антигенов, подобных антигену Т ДНК-содержащих онкогенных вирусов, то недавно такой белок был найден. Онкобелки ассоциированы с тирозинспецифической фосфопротеинкиназной активностью, необходимой, по-видимому, для индукции злокачественного роста. Фосфорилирование — событие, предшествующее трансформации, а не следствие ее. Доказано участие трансформирующих белков ряда вирусов RSV, R77, FSV, PRCII, Y73, A-MuEV, S-T-FeSV в фосфорилировании белков клетки-хозяина по тирозину, что может явиться решающим событием в развитии процесса трансформации [Beemon К, Adkins В, 1981]. Найдена прямая зависимость между трансформированным фенотипом и степенью фосфорилирования клеточных белков-мишеней. Белок pp60src и, возможно, другие вирусные протеины осуществляют фосфорилирование нескольких белков клетки: белков цитоскелета (винкулина и др.), клеточных белков 36К и 50К по остаткам тирозина [Sefton В. et al, 1981]. Белок 50К является клеточным белком, но его синтез специфически возрастает в трансформированных RSV клетках по сравнению с таковым в нормальных клетках. Белок 50К образует комплекс с pp60src [Brugge J. et al, 1981]. Напомним, что сходный по размерам клеточный белок 53К—54К был найден в ассоциации с ДНК-связывающими белками — антигеном Т SV40 и ядерным антигеном ВЭБ (EBNA). Не исключено, что это один и тот яге клеточный белок, а фосфорилирование белков клетки-хозяина и роль этого процесса в трансформации в таком случае можно рассматривать, по-видимому, как универсальное явление.

Было показано, что посттрансляционное нарезание этого предшественника (рг130) приводит к образованию белка с молекулярной массой 25 000 и далее белков с молекулярной массой 15 000 и 12 000 — продуктов гена gag MuEV [Reynolds F. et al, 1978]. To, что этот полипротеин кодируется вирусом было доказано с помощью трансляции вирионной РНК вируса Абельсона, осуществленной в бесклеточных системах ретикулоцитов кролика [Witte О. et al, 1978] и в ооцитах Xenopus laevis [Reynolds F. et al, 1978]. Синтезированный in vitro белок ppl20 прецинитировался иммунными сыворотками к разрушенному вирусу лейкоза мышей Раушера и к белкам р15 и р12 вируса Абельсона. Трансформирующий белок A-MuEV, обозначенный как pl20gag~abl, кроме антигенных детерминант продуктов гена gag (белков р15 и р12), содержат уникальный участок «х» с молекулярной массой 90 000, который является, вероятно, продуктом экспрессии клеточных последовательностей, приобретенных вирусом [Van de Ven Wim J. et al, 1979]. Белок pl20 обладает хорошо выраженной фосфопротеинкиназной активностью {Rosenberg N. et al, 1980].Показано, что порция р120 представлена на поверхностной мембране трансформированной клетки [Witte G. et al, 1979] и, следовательно, может индуцировать противоопухолевую защиту. В сыворотках некоторых мышей-опухоленосителей содержатся антитела, реагирующие с уникальной детерминантой р120 и, возможно способствующие регрессированию опухолей у этих животных.Помимо генов src RSV и abl A-MuEV, в настоящее время известны 12 новых трансформирующих генов (онкогенов) ретро-вирусов птиц, мышей, крыс, кошек, обезьян: myb, mac, rel, myc, orb, fps, yes, ros, mos, fes, sis, ras [Coffin I. et al, 1981].

Это может быть, отчасти объяснено процессом фосфорилирования, происходящим между 10-й и 25-й минутами после синтеза белка и освобождения его из полисом. Факт наличия у pp60src фосфокиназной активности был установлен В. Sefton и соавт. (1978) независимо от R. Erickson и соавт. В то же время pp60src оказался негликозилированным белком, поскольку при маркировании in vivo он не инкорпорировал радиоактивные предшественники гликопротеидов (глюкозамин, маннозу, галактозу) в тех же условиях, при которых хорошо метился предшественник белков вирусной оболочки PR90env/gp85.В. Sefton и соавт. (1978) удалось дифференцировать рр60згс от предшественника структурных вирусных белков, используя адсорбированную разрушенными вириоиами SB-RSV-D сыворотку. Такая сыворотка преципитировала pp60src в той же степени, что и неадсорбированная сыворотка.Кроме того, другими исследователями в результате бесклеточного синтеза, осуществленного на матрице 35S РНК RSV, были найдены два полипептида с молекулярными массами 18 000 и 25 000, которые не обнаруживались среди продуктов трансляции 35S РНК из мутанта RSV, дефектного по трансформации. Эти белки не преципитировались моноспецифическими сыворотками к структурным белкам ретровирусов птиц. Авторы пришли к заключению, что эти белки кодируются геном src и один из них (или оба) может быть ответственным за вызываемую KSV трансформацию клеток [Kamine J. et al, 1977, 1978].J. Stephenson и соавт. (1978) в трансформированных вирусом лейкоза мышей Абельсона (A-MuLV) вируснепродуцирующих клетках норок и мышей обнаружили полипротеин (молекулярная масса 110 000—130 000), содержавший вирусные структурные и неструктурные компоненты.

Но он может быть связан и с наружной поверхностью клетки и секретировать во внеклеточное пространство [Barnekow A. et al, 1980, 1981].Белок с такими же как и pp60src антигенными и биохимическими свойствами, в частности молекулярной массой и пептидным составом, был синтезирован в бесклеточной системе ретикулоцитов кролика с помощью вирионной 70S РНК [Purchio А. et al, 1978; Erickson R. et al, 1978] и цитоплазматических 21S полиаденилированных вирусспецифических РНК из клеток цыплят, трансформированных RSV [Erickson R. et al, 1979]. М. Collett и R. Erickson (1978, 1979) продемонстрировали, что pp60src как синтезированный in vitro, так и из трансформированных RSV клеток, ассоциирован с фосфокиназной активностью. Авторы предположили, что вирусспецифическая протеинкиназа, связанная с этим белком, играет важную роль в трансформации клеток под действием RSV.Идентичный полипептид был охарактеризован другой группой ученых [Sefton В. et al, 1978]. Сравнивались продукты гена src нескольких штаммов RSV, полученные при помощи трансляции 70S вирионных РНК, с продуктами, присутствующими в трансформированных клетках. На основании полученных результатов был сделан вывод о том, что различные штаммы вируса кодируют отличающиеся друг от друга по биологическим, биохимическим и иммунологическим свойствам белки — продукты гена src [Purchio A. et al, 1978; Beemon К. et al, 1978, 1979]. Так, белок из PR-RSV-C-трансформированных клеток имел молекулярную массу 60 000, из SR-RSV-D – 58 000, а из SR-RSV-A – 57 000, причем каждый полипептид, выделенный из трансформированных клеток, был несколько больше по размерам, чем белок, синтезированный in vitro.

Этот белок был найден также в клетках хомяков, трансформированных SR-RSV, при отсутствии в них структурных группоспецифических белков (ГС). В качестве доказательств того, что этот белок специфичен для процесса вирусиндуцированной трансформации, были представлены следующие факты. Различные клетки птиц и млекопитающих, трансформированные SR-RSV, содержали белок pp60src, идентифицированный с помощью радиоиммунологического и пептидного анализа [Brugge J. et al, 1978]. J. Brugge и соавт. (1979) обнаружили pp60src и в незараженных клетках, хотя содержание его было в 40—50 раз ниже, чем в трансформированных клетках. Белок pp60src не присутствовал в клетках, инфицированных делеционными td-мутантами ASV, дефектными по способности вызывать трансформацию клеток, или лейкозными вирусами птиц. Белок pp60src и родственные ему белки не синтезировались в бесклеточных системах in vitro на матрицах РНК саркоматозных вирусов птиц, имевших делении в гене src (SR-td). Это обстоятельство явилось наиболее веским аргументом в пользу того, что pp60src возникает в результате трансляции src-специфических последовательностей [Beemon К. et al, 1977, 1978; Pur-chio A. et al, 1977, 1978]. 4. Src-специфический белок не преципитировался антисыворотками пи к одному из известных вирионных белков вирусов лейкозно-саркоматозного комплекса птиц [Brugge J, Erickson R, 1977]. 5. Кроме того, pp60src отличался по пептидному составу от предшественника белков ГС-комплекса — IV76.В отличие от антигена Т SV40, большая часть (или фракция) которого локализуется в ядрах клеток, pp60src находится преимущественно в цитоплазме трансформированных вирусом клеток (причем 80—90% его находится в растворимой и 10—20% — в нерастворимой форме, хотя этот процент варьирует в зависимости от вида клеток) и на внутренней поверхности плазматической мембраны.

Путем гибридизации 3Н-ДНК-транскрипта ASV с РНК вируса, дефектного по трансформации, была получена ДИК 0, состоящая из 1500 пар нуклеотидов и гибридизировавшаяся с РНК саркоматозных, но не лейкозных вирусов птиц, не содержащих трансформирующий ген [Varmus Н. et al.; 1977,, 1978].Клонированный при помощи методов генной инженерии провирус Mo-MuSV способен трансформировать нормальную клетку, хотя для эффективной трансформации необходим не весь геном, а, по-видимому, лишь два участка генома — онкоген (v-mos) и так называемый длинный концевой повтор — LTR (long, terminal repeat) . LTR-фрагменты, расположенные на концах провирусной ДНК ретровирусов типа С, усиливают трансформирующий потенциал v-onc, так как содержат сильный промотор [Blair D. et al,, 1981; Ju G. et al, 1982]. Полагают, что LTB могут играть существенную роль в регуляции экспрессии вирусных генов, а также клеточных онкогенов [Temin Н, 1982]. Специфичные для трансформации вирусные последовательности экспрессируются с высокой эффективностью, поскольку они, очевидно, находятся под контролем регулирующих сигналов к инициации транскрипции, поступающих с LTR [Blair D. et al, 1980]. Установлено, что котрансфекция клеток субгеномными фрагментами, содержащими v-mos и LTB, приводит к увеличению уровня трансформации клетки, тогда как фрагмент v-mos в отсутствии LTR обладает гораздо менее выраженной трансформирующей способностью [Blair D. et al, 1981, 1982].Но особое внимание исследователей привлек белок с молекулярной массой 60 000, который не преципитировался антисыворотками к структурным вирусным белкам и был обозначен как pp60src.

Если положение об интеграции геномов ДНК-содержащих онкогенных вирусов с геномами клеток хозяина как основы злокачественной конверсии клеток получило широкое признание, то возможность интеграции генома РНК-содержащих опухолеродных вирусов в ДНК клетки считалась долгое время нереальной. В 1963 г. II. Temin на основании установленного им факта чувствительности репликации вируса саркомы Рауса (RSV) к актиномицину D, блокирующему синтез РНК на ДНК-матрице, первый высказал предположение о существовании промежуточной ДНК, названной им ДНК-провирусом. Так провирусная ДНК синтезируется в процессе репродукции ретровирусов на матрице 70S вирионной РНК и способна интегрировать с геномом клетки, вызывая при определенных условиях ее трансформацию [Temin Н, 1964]. Подтверждением гипотезы Н. Temin явилось открытие в 1970 г. фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы, или обратной транскриптазы, осуществляющей синтез ДНК-транскрипта [Temin Н, 1970; Baltimore D, 1970].Казалось вероятным предположение, что существует специфический ген ретровирусов — онкоген, который не будучи необходимым для репродукции вирионов, индуцирует и поддерживает злокачественную трансформацию клеток. В дальнейшем такой ген был идентифицирован в составе онкогенных птичьих ретровирусов, к которым относятся вирусы сарком и острых лейкозов птиц, саркоматозных вирусов мышей, крыс, кошек и обезьян [Var-mus Н. et al, 1977; Stehelin D. et al, 1980; Bobbins K. et al, 1982]. В отличие от антигена Т-продукта гена А паповавирусов продукт онкогенов ретровирусов оставался неизвестным до сравнительно недавнего времени, хотя давно существовало мнение, что трансформирующий ген ретровирусов кодирует гипотетический белок (или белки), который ответствен за индукцию трансформации клеток. Не так давно стало известно, что трансформирующие ретровирусы имеют свои индивидуальные трансформирующие гены или онкогены, которым соответствуют определенные белковые продукты, ассоциированные с неопластической трансформацией.

Продуктивная инфекция и злокачественная трансформация клеток ретровирусами не взаимоисключают друг друга, как у ДНК-содержащих онкогенных вирусов. Персистенция ретровирусов в опухолевых и трансформированных клетках значительно усложняет специфические антигенные характеристики клеток, поскольку приводит к появлению в них двух различных классов веществ. Антигенные свойства инфицированных и трансформированных ретровирусами клеток могут быть обусловлены как вирусными структурными компонентами, вошедшими в состав клетки, так и индуцированными вирусом невирионными белками. Следовательно, главная трудность для исследователей заключается в том, чтобы с помощью адсорбированных антисывороток дифференцировать в клетке антигены, являющиеся составной частью вирионов, от индуцированных вирусом антигенов, не входящих в структуру вирионов. Следует еще иметь в виду, что в инфицированных ретровирусами клетках присутствуют вирусспецифические полипротеины — так называемые предшественники вирусных структурных внутренних либо оболочечных белков. Такие высокомолекулярные предшественники отсутствуют как в нормальных клетках, так и в зрелых вирусных частицах, однако обычно преципитируются из клеточных экстрактов антисывороткой к разрушенным вирионам [Dickson S, 1976; Sovova V, Bosch V, 1976; McGimis J. et al, 1978]. В опухолевых клетках, индуцированных ретровирусами типа С, выделяют три основные группы ассоциированных с вирусами антигенов: структурные вирусные белки, вирусасоциированные неструктурные белки, индуцируемые и кодируемые вирусами, и опухолеспецифические белки, кодируемые геномом клетки [Tadao А, 1976].

Поскольку синтез МА не зависит от репликации вирусной ДНК, он, вероятно, представляет собой белковый продукт, кодируемый ранним районом вирусного генома.По данным J. Tanaka, синтез поздних антигенов (ЕА), представляющих собой структурные белки вируса, начинается к 30 ч после инфицирования и достигает максимума к 66 ч, тогда как М. Stinski (1978) обнаруживал БА уже через 15 ч. М. Stinski и соавт. (1979) показали, что МА цитомегаловируса (аналогично МА ВЭБ) инкорпорируется в вирионы на поздних стадиях инфекционного цикла и индуцирует образование нейтрализующих антител. Кроме того, найдено, что латентноинфицированные и трансформированные цитомегаловирусом клетки содержат общий мембранный антиген, который распознается и подвергается специфическому разрушающему воздействию со стороны иммунных клеток селезенки [Rapp F. et al, 1975]. Это, очевидно, свидетельствует о важном биологическом значении МА в гуморальном и клеточном иммунитете.J. Cameron и С. Preston (1981) выявили 11 наиболее ранних белков (IE) цитомегаловируса с молекулярной массой 14 000— 85 000. W. Gibson (1981), изучавший наиболее ранние белки разных штаммов цитомегаловируса человека, называет основные из них —с молекулярной массой 110 000, 94 000, 79 000, 76 000, 57 000-52 000 и 38 000.Вероятно, а-белки цитомегаловируса, как и других представителей группы вирусов герпеса, осуществляют функции регуляции экспрессии вирусного генома и участвуют в трансформации.