Цитомегаловирус, как и ВЭБ, индуцирует в клетке образование ядерных антигенов. Группой исследователей с помощью ACIF показано появление ядерных, очевидно, невирионных антигенов на ранних стадиях вирусной репликации, предшествующих синтезу вирусспецифической ДНК [Battista A. et al, 1979]. Сходные по иммунологической специфичности антигены были обнаружены в трансформированных этим вирусом клетках и в опухолях человека при отсутствии в них вирионных белков и инфекционного вируса. Ранний ядерный антиген с молекулярной массой 80 000 и свойствами ДНК-связывающего белка, подобно EBNA и наиболее ранним белкам HSV найден в клетках через 3—6 ч после заражения их цитомегаловирусом [Gergely Б. et al, 1980]. W. Gibson и соавт. (1981) обнаружили, очевидно, другой ядерный невирионный антиген с молекулярной массой 51 000, который был фосфорилирован и также обладал ДНК-связывающими свойствами. Однако для образования этого антигена был необходим предварительный синтез вирусной ДНК и некоторых ранних белков.Показано, что IE-антигены обнаруживаются в ядрах клеток уже к 1—3 ч после инфицирования [Gergely Б. et al, 1975; Geder Б, 1976; Michelson-Fiske S. et al, 1977; Reynolds D, 1978]. Ранние ядерные антигены появляются к 12—24 ч независимо от синтеза вирусной ДНК [The Т. et al, 1974; Giraldo G. et ah, 1977; Reynolds D, 1978].Кроме ядерных антигенов, цитомегаловирус индуцирует мембранные антигены (МА) в продуктивно и латентно-инфицированных и в трансформированных клетках [The Т. et al, 1972; Al-brecht T, Rapp F, 1973; Eausch R. et al, 1974; Rapp F. et al, 1975; Geder Б. et al, 1976; Boldough I. et al, 1977]. T. Tanaka и соавт. (1981) иммунофлюоресцентным методом на живых клетках обнаружили появление МА на поверхности пермиссивных и непермиссивных клеток человека и животных к 24 ч после инфицирования, тогда как максимального уровня синтез этого антигена достигал к 36 ч. МА синтезируется также в присутствии ингибитора синтеза ДНК цитозинарабинозида (20 мкг/мл), однако ингибиторы синтеза РНК и белка полностью предотвращают его образование.

О возможном участии цитомегаловируса в возникновении раковых опухолей толстой кишки впервые сообщили Е. Huang и J. Roche (1978). Методом гибридизации нуклеиновых кислот они выявили вирусную ДНК в 4 из 7 исследованных раковых опухолей. Геномы вируса были найдены в тканях толстой кишки у лиц с такими предраковыми состояниями, как язвенный колит и семейный полипоз, но они отсутствовали в нормальной слизистой оболочке кишечника.G. Hashiro и соавт. (1979) выделили вирус из трех культур клеток, полученных из ткани 16 раковых опухолей толстой кишки. М. Stoian и соавт. (1982) с помощью метода фиксации комплемента исследовали большое число больных с различными формами злокачественных новообразований па присутствие антител к цитомегаловирусу. Авторы выявили антитела в 73,2% сывороток крови больных с раковыми опухолями и в 16,6% сывороток здоровых доноров. В. Bfichacek и соавт. (1980) не сумели иайти вирусспецифические ДНК-последовательности в клетках 7 аденокарцином толстой кишки, а также выявить различия менаду уровнем антител в сыворотках крови здоровых доноров и больных. A. Avni и соавт. (1981) также не обнаружили существенной разницы между среднегеометрическими титрами антител к цитомегаловирусу в сыворотках крови 37 больных аденокарциномами кишечника и здоровых лиц, использовав для этой цели реакцию энзиммеченных антител (РЭМА) к мембранному антигену. Авторы сообщили о наблюдавшемся ими повышении титров антител к цитомегаловирусу лишь у людей после иммунодепрессантной терапии. По их мнению, это может объясняться реактивацией латентного вируса. Таким образом, в связи с противоречивостью имеющихся сведений вопрос об этиологической роли цитомегаловируса человека в индукции опухолевого роста остается открытым.

Несомненно, новые антигенные маркеры могут быть использованы в целях иммунодиагностики при некоторых опухолевых процессах, а в будущем и для разработки новых путей иммунопрофилактики и специфической терапии опухолей вирусного происхождения. Долитое внимание следует, видимо, уделить опосредованному клетками и антителами иммунному ответу организма на эти антигены, проявляющемуся элиминацией опухолевых клеток и регрессией опухолей.Не менее интересным представителем группы герпесвирусов является цитомегаловирус человека, онкогенные потенции которого были продемонстрированы в опытах in vitro и in vivo [Ge-der L. et al, 1976]. В отличие от ВЭБ, мишенью для которого являются В-лимфоциты, цитомегаловирус поражает сравнительно широкий круг клеток, в том числе и Т-лимфоциты, в которых он, по-видимому, латентно персистирует. Цитомегаловирус, передающийся от матери плоду, очевидно, неблагоприятно влияет на развитие зарождающегося организма. Полагают также, что синдром инфекционного мононуклеоза наряду с ВЭБ может быть обусловлен и цитомегаловирусом [Diosi Р, David С, 1981]. Имеются сведения о связи этого вируса с аденокарциномами толстой кишки, саркомой Капоши и некоторыми другими новообразованиями человека. Полагают, что активация цитомегаловируса, как и других вирусов группы герпеса, происходит вследствие нарушения работы иммунной системы организма (иммуносупрессия). Кроме того, на развитие опухолей влияют, очевидно, генетические факторы. Возможность этиологического значения вирусов группы герпеса в возникновении новообразований у лиц с дефектами иммунной системы обсуждается многими исследователями [Purtilo D, Klein G, 1981; Saemundsen A. et al, 1981; Pur-tilo D, 1983].

Кроме того, AG-4 (ICP10) — это минорный структурный компонент, тогда как остальные белки, возможно, имеют невирионную природу. Они не были до сих пор найдены в препаратах очищенного вируса, что полностью не исключает, однако, такой возможности в будущем. Интересно, что антитела к AG-4 относятся к макроглобулинам IgM, а антитела к другим антигенам, по-видимому, принадлежат к IgG. По данным L. Aurelian (1973), IgM к AG-4 обнаруживались с помощью РСК у 35% больных цервикальной дисплазией, 65% женщин с раковыми опухолями in situ и у 85% больных с инвазивной формой рака шейки матки. На основании полученных данных делалось заключение о специфичности появления этих антител при опухолях шейки матки, но не других раках. Антитела к HSV-TAA были найдены у 90% больных с плоскоклеточными типами карцином носоглотки и в 11% случаев несквамозных раков.В дальнейшем М. Notter и J. Docherty (1976) нашли, что антитела к AG-4 и к HSV-TAA встречаются приблизительно в одинаковом проценте случаев у больных с раковыми опухолями шейки матки (соответственно в 78 и 82% случаев). J. Melnick и соавт. (1976) показали, что сыворотки крови больных с данной патологией сильнее реагируют с VP143, чем сыворотки от пациентов с другими формами рака или от здоровых женщин.По-видимому, все эти антигены относятся к ранним белкам и к а-белкам, хотя еще неясно, каковы их функции при продуктивиой инфекции и в чем заключается их участие в канцерогенезе.Еще раз подчеркиваем, что обнаруягение вирусспецифических антигенов (генетических маркеров) в клетках раковых опухолей шейки матки и некоторых других опухолей указывает на присутствие в них вирусного генома и позволяет сделать вывод о существовании причинной связи между HSV и возникновением ряда злокачественных новообразований человека.

В опытах по трансфекции были обследованы 20 образцов ДНК, полученных из клеток раковых опухолей шейки, тела матки и яичника.Помимо экспериментально инфицированных HSV клеток, антиген такой же специфичности был найден нами и в некоторых раковых опухолях человека [Косяков П. Н. и др., 1980]. Обнаружение нового невирионного антигена в новообразованиях человека (преимущественно в раковых опухолях шейки матки) дает основание предполагать, что HSV имеет этиологическое значение в возникновении этих опухолей.Установленный нами факт дал основание подойти и к изучению опухолей человека на наличие в них генетической информации HSV2, ответственной за синтез нового антигена. Выявление вирусного генетического материала в тканях опухолей человека, несомненно, служит дополнительным доказательством этиологического значения вирусов в происхояедении опухолей. С этой целью успешно могут быть использованы методы гибридизации и транс-фекции. Однако до сих пор нуклеотидные последовательности HSV были обнаружены в тканях плоскоклеточных раковых опухолей лишь в единичных случаях, описанных N. Frenkel и соавт. (1972). Авторы предположили, что для трансформации эпителиальных клеток необходима и достаточна интеграция с ДНК клетки не всего вирусного генома, а лишь отдельных небольших фрагментов ДНК, которые, по-видимому, трудно обнаружить с помощью молекулярной гибридизации. Исходя из этого, важно было попытаться найти другие достоверные признаки, доказывающие присутствие и функционирование вирусного генома. Таким показателем явился новый невирионный антиген, ассоциированный с HSV2, появляющийся в инфицированных этим вирусом клетках и найденный нами в некоторых опухолях человека.

При использовании более щадящего метода выделения ДНК трансфекция происходила эффективнее, о чем свидетельствовала возросшая активность нового антигена, дававшего выраженную реакцию с иммунной сывороткой в более высоком разведении — 1: 80. В опытах этой серии наряду с возникновением нового антигена трансфекция проявлялась синтезом структурных вирусных антигенов, реагировавших со специфической противовирусной сывороткой в разведении 1:40, или репродукцией вируса, о чем судили по наличию вирусспецифической деструкции клеток на протяжении многих пассажей (ЦНД).Биологическая активность препаратов была обусловлена ДНК, а не связана с другими компонентами вириона, поскольку инкубация ДНК с проназой, РНКазой или нагревание в течение часа при 56 °С практически не влияли на эффективность трансфекции, а ДНКаза (100—200 мкг/мл) либо полностью предотвращала, либо резко снижала способность к трансфекции. ДНК из незараженных вирусом клеток не вызывала появления нового антигена.Тот же новый антиген обнаруяшвался и в непрямой реакции иммунофлюоресценции. Клетки НЕр-2, трансфицированные ДНК из инфицированных HSV2 клеток, дают поверхностное свечение со специфической сывороткой к новому антигену уже к 4—6 ч после внесения ДНК. Незараженные клетки давали слабое фоновое свечение. Таким образом, именно ДНК 1ISV2 индуцирует и, по-видимому, кодирует синтез выявляемого невирионного антигена, ассоциированного с этим вирусом.Итак, новый антиген может непосредственно кодироваться вирусной ДНК, и напротив, нам каялется маловероятным, что он возникает вследствие вирусспецифической дерепрессии эмбриональных генов клетки-хозяина. Однако абсолютное доказательство, в пользу того, что этот антиген кодируется вирусом, может быть получено лишь в опытах in vitro транскрипции — трансляции при использовании очищенной вирионной ДНК. Было бы

Источником ДНК HSV2 служили инфицированные этим вирусом клетки при множественности инфицирования 5—10 ТЦД50 на клетку. ДНК из инфицированных клеток выделяли с помощью 0,5% SDS, фенола и проназы и его методу P. Pignatti и соавт. (1979). Этот метод, успешно использованный P. Pignatti и соавт. для выделения ДНК HSV1 из инфицированных клеток, по мнению авторов и с нашей точки зрения, имел явные преимущества перед детергентфенольным методом и методом В. Hirt (1967). Тритон Х-100-NaCl-супернатант после депротеинизации SDS и проназой содержал, в основном, интактные молекулы вирусной ДНК. Этот метод дал нам возможность получить вирусную ДНК почти без примеси клеточной ДНК, исключив, таким образом, необходимость дальнейшей ее очистки с помощью ультрацентрифугирования в градиенте плотности CsCl. Трансфекцию осуществляли с помощью кальций-фосфатного метода по F. Graham (1973) в сочетании с обработкой монослоя клеток 10% диметилсульфоксидом по N. Stow и N. Willrie (1978).Оказалось, что ДНК, полученная из инфицированных HSV2 клеток, обладает свойством индуцировать образование в клетке пового невирионного антигена. Образцы ДНК были способны регулярно индуцировать синтез нового антигена в клетках различного происхождения, а в некоторых экспериментах — структурных белков и инфекционного вируса к 24—48 ч. ДНК, выделенная SDS-фенольным методом, индуцирует образование нового антигена, реагирующего в РСК с иммунной сывороткой в разведении 1:40. Однако при этом способе получения ДНК ни в одном случае не наблюдали синтеза структурных белков, что, возможно, обусловлено значительными повреждениями вирионной ДНК, возникшими в результате воздействия фенолом.

Подтвержением тому, что новый антиген синтезируется на ранних стадиях репродукции вируса, могут слуяшть опыты с ингибиторами синтеза нуклеиновых кислот. Продукция нового антигена пе подавлялась ингибиторами синтеза ДНК — митомиципом С (60 мкг/мл) и цитозинарабинозидом (20 мкг/мл), которые блокировали вирионные антигены. Это свидетельствует о том, что новый антиген является ранним белком, синтезирующимся до начала репликации вирусной ДНК. На основании этого был сделан вывод о различиях генетической информации для кодарования структурных белков и виру сии дуцированного нового антигена. Циклогексимид подавлял синтез как вирусного, так и нового антигенов. Был исследован синтез нового антигена в условиях, стимулирующих продукцию наиболее ранних белков (а): после снятия циклогексимидного блока синтеза белка в присутствии актиномицина D. В культуры клеток в момент зараяления вносили циклогексимид (50 мкг/мл) на 7—8 ч (что не влияет на раннюю транскрипцию), а затем циклогексимид удаляли путем многократного отмывания и вводили на 2 ч актиномицин D (2,5 мкг/мл), блокирующий дальнейшую продукцию и РНК. В этих условиях синтез самых ранних белков увеличивался. На основании полученных данных изучаемый антиген мог быть отнесен к IE или а-белкам по терминологии, предложенной R. lioness и В. Roizman (1974).Следующий этап исследований был посвящен выяснению роли вирусной ДНК в появлении нового антигена. С этой целью использовали метод трансфекции ДНК, полученной из инфицированных HSV2 клеток различного происхождения. Результаты опытов оценивали на основании обнаруясения в трансфицирован-ных ДНК клетках вирусспецифических антигенов, синтезирующихся в результате экспрессии вирусной генетической информации при помощи РСК и непрямого метода иммунофлюоресценции со специфическими сыворотками к новому антигену и к вирусу.

Содержание раннего невирионпого антигена увеличивалось к 18—24 ч в литически инфицированных клетках, к этому же времени в них обнаруячивались и антигены вируса. HSV1 и HSV2 индуцировали в клетках антигены одинаковой специфичности. Реакциями непрямой иммупофлюоресценции на живых клетках по Мюллеру и смешанной гемадсорбции (дисковый тест) [Fagraeus А., Espmark А., 1961] было показано, что новый антиген локализуется на поверхностных мембранах клетки.Трем 10-кратпым разведениям антисыворотки к новому антигену (1:10, 1:100 и 1:1000) соответствовали зоны с диаметрами 23, 18 и 12 мм. Видны две зоны гемадсорбции округлой формы, расположенные там, где были нанесены фильтровальные диски с антисывороткой к новому антигену. Антивирусная сыворотка не выявляла антигенов вируса к этому времени. Как сыворотка к новому антигену, так и антивирусная сыворотка к 24 ч давали выраженную реакцию с почти одинаковыми диаметрами зон гемадсорбции при аналогичных разведениях (1:10, 1:100 и 1:1000). Это подтверждает данные РСК о наличии в клетках, инфицированных HSV, двух различных антигенных специфичности.Опыты по биологической нейтрализации вируса также свидетельствуют о различии иммунных сывороток к новому и вирусному антигенам. Иммунная сыворотка к новому невирионному антигену слабо нейтрализовала инфекционность интактного вируса (индекс нейтрализации 0,5 lg), тогда как нейтрализующая активность сыворотки к вирусу была высокой (индекс нейтрализации 3,5—4,5 lg).Найденный новый антиген, как AG-4 (ICP10) и NV-TAA, выявляется уже к 3—4 ч после инфицирования клеток, т. е. до синтеза вирусных структурных белков, которые появляются в более поздние сроки.